Giám mục Giuse Trần Văn Thiện sinh ngày 1 tháng 10 năm 1908. Theo nguồn tin của giáo phận Mỹ Tho và sách Việt Nam Giáo sử Quyển II của Phan Phát Huồn, Giám mục Thiện sinh tại Ngũ Hiệp (Cù lao Năm Thôn), huyện Cai Lậy, tỉnh Định Tường (nay thuộc xã Ngũ Hiệp, huyện Cai Lậy, tỉnh Tiền Giang.[9][10][11] Một số nguồn tin khác cho rằng ông sinh tại Bạc Liêu.[12]

Cha ông đảm nhận vai trò Trùm thuộc Giáo họ Ngũ Hiệp. Từ thuở nhở, cậu bé Trần Văn thiện được gia đình gửi đến học tại Trường trung học Công giáo của Họ Mỹ Tho, do các tu sĩ dòng Lasan điều khiển. Những khoảng thời gian ngoài giờ học, cậu về sinh hoạt cùng gia đình tại Ngũ Hiệp.[7][8]

Với chí hướng tu học từ nhỏ, sau khi hoàn thành chương trình Tiểu học, Trần Văn Thiện rời gia đình, bắt đầu con đường tu học bằng việc nhập học tiểu chủng viện tại Sài Gòn. Sau khoảng thời gian dài học Tiểu chủng viện, chủng sinh Thiện tiếp tục con đường tu học tại Đại Chủng viện.[7][8]